Conseils et Astuces

Manipulation des Oligos ADN

Lorsque vous manipulez des oligonucléotides d'ADN, veuillez tenir compte de ce qui suit :

• Veillez à n'utiliser que des solutions exemptes de nucléase (voir notre suggestion ci-dessous pour les solvants potentiels)
• Manipuler avec précaution pour éviter toute contamination bactérienne
• Les oligos sont généralement plus stables à des concentrations plus élevées
• Certains Dyes fluorescents (en particulier les Dyes Cy) sont particulièrement sensibles à la lumière, et l'exposition à la lumière doit être réduite au minimum. De plus, certains Dyes peuvent être sensibles à l'oxydation. Par conséquent, veillez à n'ouvrir le tube que si nécessaire.

Comment Dissoudre votre Oligo ?

En général, les oligonucléotides sont mieux dissous dans de l'eau stérile ou dans un tampon Tris-HCl 10 mM (pH 7,5). Toutefois, il existe quelques exceptions qui nécessitent une attention particulière :

• Les oligos portant un Dye fluorescent ne doivent pas être dissous dans l'eau distillée. L'eau distillée a généralement un pH d'environ 6,0, ce qui favorise la dégradation du dye fluorescent. Dans ce cas, n'utilisez que du tampon Tris-HCl 10 mM à pH 7,5.
• Les oligos portant des dyes fluorescents de la famille des cyanines, tels que Cy3, etc., ne doivent pas être dissous dans un tampon Tris-HCl 10 mM à pH 7,5, car ils se dégradent lentement à un pH >7,5. Dans ce cas, utilisez uniquement de l'eau distillée.

Comment Remettre votre Oligo en Suspension ?

• Faites une centrifugation à vitesse maximale dans une centrifugeuse pour récupérer le culot au fond du tube
• Ajouter une quantité appropriée d'eau stérile ou de tampon
• Chauffer le tube pendant 5 minutes à 65 °C
• Vortexez ou mélangez en pipettant vigoureusement de haut en bas

Comment hybrider des oligos complémentaires ?

Option 1 :
Matériel :
1x tampon d’hybridation (c.-à-d. Tris-HCl 10 mM, pH 7.5-8, 20 mM NaCl ou un autre tampon couramment utilisé)

• Dissolvez vos oligos à 200 µM dans le tampon d’hybridation. Utilisez donc la moitié du volume de tampon indiqué dans la fiche technique.
• Mélangez les deux Oligos dans un rapport 1:1.
• Chauffez la solution à 92°C et maintenez-la pendant 2 min.
• Refroidissez à la température ambiante en retirant le tube de la source de chaleur.
• Votre double brin sera hybridé à 100 µM (100 nmol/ml) dans du Tris-HCl, pH 7,5-8, 20 mM NaCl (ou un autre tampon).

Option 2 :
Matériel :
Tampon d’hybridation 5x (c.-à-d. Tris-HCl 50 mM, pH 7,5-8, 100 mM NaCl ou autre tampon 5x couramment utilisé)

• Dissolvez votre Oligo à 100 µM dans de l'eau pure (les informations sur le volume sont données dans la fiche technique). Vous pouvez également commander les Oligos déjà dissous à 100 µM (100 nmol/ml) chez Microsynth.
• Mélanger les deux Oligos dans un rapport de 1:1.
• Ajouter le tampon dans un rapport de 4 parts de solution oligo et 1 part de tampon d’hybridation 5x 4:1 (v:v).
• Chauffer la solution à 92°C et la maintenir pendant 2 min.
• Refroidissez à la température ambiante en retirant le tube de la source de chaleur.

Votre double brin sera hybridé à 40 µM (40 nmol/ml) dans du Tris-HCl, pH 7,5-8, 20 mM NaCl (ou un autre tampon).

Stockage des Oligos d'ADN

Si vous souhaitez stocker des oligonucléotides, veuillez considérer les points suivants :

• Veuillez éviter les décongélations et congélations répétées car les forces physiques impliquées peuvent dégrader vos oligos
• En fonction de votre expérience, veuillez choisir une condition de stockage appropriée (voir nos suggestions de conditions de stockage potentielles ci-dessous)
• La préparation des aliquotes peut être utile si les oligos doivent être stockés et utilisés sur une longue période sans perdre leur activité

Manipulation des Oligos d'ARN

Lorsque vous manipulez des oligonucléotides d'ARN, veuillez tenir compte de ce qui suit :

• Assurez-vous que vous travaillez sans RNase et que vous utilisez uniquement des solutions sans nucléase (voir notre suggestion ci-dessous pour les solvants potentiels)
• Manipuler avec précaution pour éviter toute contamination bactérienne
• Les oligos sont généralement plus stables à des concentrations plus élevées
• Certains Dyes fluorescents (en particulier les Dyes Cy) sont particulièrement sensibles à la lumière et doivent être conservés dans des tubes étanches à la lumière. De plus, certains Dyes peuvent être sensibles à l'oxydation. Veillez donc à n'ouvrir le tube qu'en cas de besoin.

Comment Dissoudre votre siRNA ou ARN Simple Brin ?

En général, les oligonucléotides sont mieux dissous dans de l'eau stérile exempte de RNase ou dans un tampon Tris-HCl 10 mM (pH 7,5). Cependant, il existe quelques exceptions qui nécessitent une attention particulière :

• Les oligos portant un Dye fluorescent ne doivent pas être dissous dans l'eau distillée. L'eau distillée a généralement un pH d'environ 6,0, ce qui favorise la dégradation du Dye fluorescent. Dans ce cas, n'utilisez que du tampon Tris-HCl 10 mM à pH 7,5.
• Les oligos portant des Dyes fluorescents de la famille des cyanines, tels que Cy3, etc., ne doivent pas être dissous dans un tampon Tris-HCl 10 mM à pH 7,5, car ils se dégradent lentement à un pH >7,5. Dans ce cas, utilisez uniquement de l'eau distillée.

Comment Remettre en Suspension ou Hybrider votre siRNA ?

Le siRNA est généralement livré sous forme de duplex hybridé, purifié et prêt à l'emploi. Toutefois, sur demande, nous les livrons sous forme séchée, en brins séparés, dans deux tubes distincts. Si vous ne savez pas comment l'hybdrider, veuillez respecter le protocole suivant :

• Préparez des solutions de 100 µM de chaque brin d'ARN. Mélangez 30 µl de chaque solution d'oligo ARN et ajoutez 15 µl de tampon annealing 5x pour atteindre un volume final de 75 µl. La concentration finale du duplex doit être de 40 µM.
• Incuber la solution pendant 1 à 2 minutes à 90-95 °C. Conservez ensuite cette solution sur la paillasse jusqu'à ce qu'elle atteigne la température ambiante (le refroidissement doit être relativement lent et prendre environ 45-60 minutes). Centrifuger brièvement le tube pour recueillir tout le liquide au fond du tube.
• Une fois hybdridé, le siRNA duplex est beaucoup plus résistant aux nucléases que l'ARN simple brin et il est préférable de le conserver à -20 °C. Le tampon d'annealing 5x peut être congelé-décongelé jusqu'à 5 fois.

Comment Remettre en Suspension l'ARN Simple Brin ?

• Faites une centrifugation courte à vitesse maximale dans une centrifugeuse pour récupérer le culot au fond du tube
• Ajouter une quantité appropriée d'eau stérile exempte de RNase ou de tampon
• Chauffer le tube pendant 2-3 minutes à 90 °C
• Vortexez ou mélangez en pipettant vigoureusement de haut en bas

Précautions contre la Contamination par la RNase

L'ARN est sujet à la dégradation en raison de son groupe 2'-hydroxy libre. Les principales causes de dégradation sont l'activité des RNases ainsi que l'incubation prolongée dans des solutions alcalines. Veuillez observer les précautions suivantes pour aider à garder votre ARN intact :

• Travaillez toujours avec des consommables en plastique neufs et jetables (par exemple, marquez un sac de tubes et mettez-le de côté. Ne saisissez jamais le sac, mais faites plutôt tomber les tubes hors du sac. Cela s'applique également aux cônes de pipettes. Si vous devez utiliser de la verrerie, sachez que les RNases peuvent survivre à l'autoclavage - dans ce cas, faites autoclaver votre verrerie à 250 °C pendant au moins 4 heures.
• Portez toujours des gants (les RNases sont omniprésentes). Changez de gants fréquemment (sachez que toute surface que vous pourriez toucher avec vos gants peut avoir déjà été touchée par une personne ne portant pas de gants).
• Utilisez de l'eau/des tampons sans RNase. La plupart des eaux disponibles dans le commerce sont en fait exemptes de RNase. Vous pouvez également produire de l'eau DEPC. Le DEPC (Diethylpyrocarbonate) réagit avec les groupes amines primaires et inactive donc les RNases, mais ne peut pas être utilisé pour les tampons Tris par exemple.

Stockage des Oligos d'ARN

Si vous souhaitez stocker des oligonucléotides, veuillez considérer les points suivants :

• Veuillez éviter les décongélations et congélations répétées car les forces physiques impliquées peuvent dégrader vos oligos
• En fonction de votre expérience, veuillez choisir une condition de stockage appropriée (voir nos suggestions de conditions de stockage potentielles ci-dessous)
• La préparation des aliquotes peut être utile si les oligos doivent être stockés et utilisés sur une longue période sans perdre leur activité

Recommandations pour les Sondes Taqman
Recommandations pour le Sesign des Amorces
Recommandations Générales pour la Conception des Oligonucléotides LNA
Recommandations pour le Design des siRNA

Recommandations pour les Sondes Taqman

• Longueur optimale : 20 bases
• Gamme de longueur : 18-30 bases (Une longueur supérieure à 30 bases est possible ; dans ce cas, il est recommandé d'utiliser des sondes à double quencher et de placer un quencher interne supplémentaire à une distance de 8-10 bases du fluorophore.
• Température de fusion (Tm) : 68-70°C. Veuillez-vous assurer que la Tm de votre sonde est supérieure de 8 à 10°C à la Tm de vos amorces (8°C pour le génotypage, 10°C pour le profilage de l'expression).
• Teneur en GC : 30-80%
• Évitez les séries de nucléotides identiques, en particulier de 4 ou plus G (sinon l'interaction entre les nucléotides peut entraîner la formation d'une structure secondaire par l'oligo)
• Sélectionnez le brin qui donne à la sonde plus de C que de G (en raison de la forte interaction que G affiche avec lui-même)
• Ne pas mettre de G à l'extrémité 5' (quenche le fluorophore)
• En cas d'utilisation dans le cadre d'essais multiplex (discrimination alléliques), il faut tenir compte de ce qui suit :
  
  • Positionner le polymorphisme au centre de la sonde
  • Ajustez la longueur de la sonde de afin que les deux sondes aient la même Tm
  • Si des sondes très courtes sont nécessaires (moins de 18 bases), veuillez nous consulter

Recommandations pour le Design des Amorces

• Gamme de longueur : 18-30 bases
• Température de fusion (Tm) : 58-60°C
• Contenu du GC : 30-80%
• Éviter les séries de nucléotides identiques, en particulier de 3 G ou C ou plus à l'extrémité 3'
• Le nombre total de G et de C dans les cinq derniers nucléotides à l'extrémité 3' de l'amorce ne doit pas dépasser deux
• Les amorces doivent scanner la jonction exon-exon. L'ADN génomique contaminé ne sera pas amplifié par ces amorces

Recommandations Générales pour la Conception des Oligonucléotides LNA

Contrairement aux oligonucléotides standard d'ADN ou d'ARN, les oligonucléotides à nucléotides LNA ont tendance à être plus courts en raison de leur température de fusion nettement plus élevée et de la plus grande sensibilité qui y est associée. Lors de la conception d'oligonucléotides contenant des LNA, les règles générales suivantes doivent être prises en compte :

• Les LNA doivent être introduits aux positions où la spécificité et la discrimination sont nécessaires (par exemple, l'extrémité 3' dans la PCR allèle spécifique et la position SNP dans les sondes d'hybridation spécifiques à l'allèle).
• Évitez les stretches de plus de 4 nucléotides LNA. Les LNA s'hybrident très étroitement lorsque plusieurs résidus consécutifs sont substitués par des nucléotides LNA.
• Évitez l'autocomplémentarité des LNA et leur complémentarité avec d'autres oligonucléotides contenant des LNA dans le test. Les LNA se lient très étroitement aux autres résidus LNA.
• Une longueur typique pour les amorces est de 18mer et ne devrait pas contenir plus de 8 nucléotides LNA.
• Chaque nucléotide LNA augmente la Tm d'environ 2-4°C.
• N'utilisez pas de blocs de LNA près de l'extrémité 3'.
• Maintenez la teneur en GC entre 30 et 60 %.
• Évitez les stretches de plus de 3 ADN G ou nucléotides LNA.
• La Tm des paires d'amorces doit être presque égale.

Pour paramétrer des analyses très spécifiques ou novatrices, il peut être nécessaire d'établir des règles de conception de manière empirique, mais le respect des recommandations ci-dessus constituera un bon point de départ.

Recommandations pour le Design des siRNA

Trouver la stratégie de design optimale du siRNA est un domaine de recherche active. Récemment, plusieurs études ont souligné l'importance de plusieurs facteurs pour un siRNA efficace. L'inclusion de ces critères (dérivés empiriquement) dans le design d'un siRNA augmente les chances de créer un siRNA spécifique et très efficace en termes de knockdown.

Les critères de Reynolds [1, 2] sont des critères importants :

• La teneur en GC du siRNA doit être comprise entre 30 et 52 %.
• Essayez de placer au moins 3 A/U en position 5-19 du brin sensoriel.
• Assurez-vous qu'il y a une absence de répétitions internes (Tm de la structure secondaire < 20°C).
• Essayez de placer un A à la position 19 du brin sens.
• Essayez de placer une base A à la position 3 du brin sens.
• Essayez de placer une base U à la position 10 du brin sens.
• Essayez de placer une base autre que G ou C à la position 19 du brin de sens.
• Essayez de placer une base autre que G à la position 13 du brin sens.

Notez que tous ces critères ne doivent pas être remplis, mais en général, plus il y en a, mieux c'est.

Notre outil de conception de siRNA en ligne trie les résultats avec un numéro de score qui reflète ces critères et vous aide à concevoir vos siRNAs rapidement, de manière fiable et pratique. Il s'agit d'un outil personnalisé qui combine les critères de conception publiés et l'expérience de Microsynth. Pour utiliser notre outil de conception, veuillez d'abord vous connecter à notre boutique en ligne et choisir siRNA > siRNA Design Tool.

1. Boese et al. (2005). Mechanistic Insights Aid Computational Short Interfering RNA Design. Methods in Enzymology. Vol 392. Pages: 73-96
2. Reynolds et al. (2004). Rational siRNA design for RNA interference, Nature Biotechnology. Vol 22. Pages: 326-330

Traditionnellement, FAM-TAMRA est le couple les plus fréquemment utilisé pour les sondes TaqMan dans lesquelles FAM agit comme fluorophore et TAMRA comme quencher. D'autres quenchers peuvent également être utilisés, en particulier les quenchers sombres ou les quenchers black hole (BHQ) qui captent l'énergie d'une molécule rapporteur excitée sans émission ultérieure de lumière, c'est-à-dire qu'ils ne sont pas fluorescents.

Les sondes fabriquées à l'aide quenchers sombres ont tendance à être plus sensibles dans les systèmes de détection quantitative, principalement en raison d'une fluorescence de bruit de fond plus faible et d'un meilleur rapport signal/bruit que les sondes qui contiennent des quenchers fluorescents. En outre, les quenchers sombres permettent d'utiliser une plus grande variété de Dyes rapporteurs, ce qui élargit les options disponibles pour les essais multiplex ou de génotypage.

Certains fluorophores peuvent être éteints par plus d'un quencher. Dans tous les cas, le spectre d'absorption du quenchers doit avoir un bon chevauchement avec le spectre d'émission du fluorophore pour obtenir une extinction optimale. Les quenchers ont une capacité d'extinction sur l'ensemble de leur spectre d'absorption, mais leur performance est optimale lorsqu'elle est proche du maximum d'absorption.

Pour la PCR multiplex, nous recommandons les combinaisons suivantes de fluorophores 5' et de black hole quencher 3' (qui conviennent à la plupart des thermo-cycleurs de qPCR utilisant des sondes TaqMan) :

• Canal 1: FAM-MGBQ530
• Canal 2: HEX/JOE/Yakima Yellow*- MGBQ530 (*equivalent to VIC)
• Canal 3: ROX**-BHQ-2 (**equivalent to Texas Red)/ATTO550***-BHQ-2 (***equivalent to NED)
• Canal 4: Cy5-BHQ-2
• Canal 5: Dy681-BHQ2

Concentrations finales recommandées pour les expériences standard :

• Amorces : 0,9 pmol/µl (0,9 µM)
• Sondes : 0,2 pmol/µl (0,2 µM)

Conditions recommandées pour la PCR en temps réel (amorce Tm : 59 °C, sonde Tm : 69 °C) :

• 30 sec 95 °C
• 30 sec 57 °C
• 30 sec 72 °C, 35 cycles