Frequently Asked Questions - Next Generation Sequencing

Ja, wir führen eine gründliche Eingangsqualitätskontrolle Ihrer Proben durch. Stellen Sie dennoch sicher, dass Sie Ihre eigene Qualitätskontrolle durchführen, bevor Sie die Proben versenden, um Verzögerungen oder andere Probleme bei der Verarbeitung zu vermeiden.

• Proben werden 3 Monate lang gelagert
• Benutzerdefinierte NGS-Primer werden 2 Jahre lang aufbewahrt

Dies ist eher schwierig pauschal zu beantworten, am besten Sie kontaktieren uns, um Ihr Projekt im Detail zu besprechen.

Bitte füllen Sie alle Wells spaltenweise.
Bei Projekten mit mehr als 4 x 96-Well-Platten setzen Sie sich bitte mit uns in Verbindung, um ein effizientes Plattendesign zu besprechen.

Sowohl die Amplikonsequenzierung als auch die Whole-Genome-Metagenom-Sequenzierung haben ihre eigenen Vor- und Nachteile. Die Wahl der Methode sollte erstens auf der Grundlage des Forschungsziels und zweitens unter Berücksichtigung der gegebenen Einschränkungen getroffen werden. Die Vorteile der Amplikon-Metagenomik sind: hohe Empfindlichkeit, gute Bewertung der taxonomischen Zusammensetzung und Vielfalt, Eignung und damit statistische Aussagekraft für eine große Anzahl von Proben. Die Vorteile von Whole Genome Metagenomics sind: Keine taxonspezifische PCR-Verzerrung (und keine Beschränkung auf eine primersetabhängige Amplifikation).

Ribosomale RNA (rRNA) ist der am häufigsten vorkommende Bestandteil (> 80 %) der aus Zellen oder Geweben isolierten Gesamt-RNA. Für die meisten Anwendungen ist die rRNA jedoch irrelevant. Ihre Sequenzierung erhöht daher die erforderliche Sequenzierkapazität und letztlich auch die Kosten der Analyse. Wenn eine Poly(A)-Anreicherung nicht möglich oder erwünscht ist, muss die Gesamt-RNA in den meisten Fällen ribo-depletiert werden. Die Ribo-Abreicherung ermöglicht darüber hinaus den Nachweis anderer RNA-Spezies als mRNA, weshalb die Sequenziertiefe möglicherweise angepasst werden muss.

In den meisten Fällen liegt dies entweder an einer Inkompatibilität zwischen der Probe und dem Ribodepletions-Kit (die Ribodepletion ist sequenz- und damit speziesabhängig, und selbst subtile Sequenzvariationen können einen erheblichen Einfluss haben) oder an Verunreinigungen in der Probe (z.B. Metaboliten, hohe Salzkonzentrationen) oder an einer möglichen gDNA-Kontamination.

Um es einfach auszudrücken:

• Sequenziertiefe bedeutet Sensitivität
• Read-Länge bedeutet Spezifität
• Replikate bedeuten Konfidenz

Typische Sequenzierungstiefen sind 30 Mio. Read-Pairs (Säugetiere, mRNASeq), 5 Mio. Read-Pairs (Bakterien, mRNASeq; small RNA Seq) oder 15-20 Mio. Read-Pairs (Pilze, mRNASeq; ChIPSeq).

Proben mit stark degradierter DNA oder hohen Konzentrationen von hemmenden Metaboliten werden wahrscheinlich nicht analysiert oder liefern nur eine begrenzte Darstellung der vorhandenen Artengemeinschaften. Um falsch-positive Ergebnisse zu vermeiden, sollte eine Negativkontrolle (am besten gleicher - aber analytfreier - Herkunft wie die Probe) zusammen mit den Proben analysiert werden.

Die Daten werden für 3 Monate gespeichert.

Ja, das tun wir, bitte kontaktieren Sie unsere Bioinformatik-Spezialisten.

Neben der Resequenzierung sind viele Anwendungen wie z. B. die Transkriptomsequenzierung auf ein qualitativ hochwertiges Referenzgenom als Basis für die tiefergehende Analyse angewiesen. Die vollständige Referenzsequenz stellt sicher, wo gezählt werden soll, während die vollständige Referenzannotation sicherstellt, was gezählt werden soll. Zusätzliche Annotationen eines Referenzgenoms ermöglichen weitere tiefere Analysen wie z. B. die Analyse von Signalwegen, die Erkennung alternativer Transkripte,...

Es gibt immer Umgehungsmöglichkeiten - bitte kontaktieren Sie uns für weitere Informationen..

Je nach Wahl der Zielregionen können alle Bakterien-, Archaeen- und Pilzarten identifiziert werden, deren Sequenz in einer entsprechenden Datenbank (z. B. RDP, Unite, Silva) veröffentlicht ist. Derzeit gibt es beispielsweise Tausende von Arten mit Sequenzeinträgen in der Datenbank. Die Proben werden auf Artenebene angegeben, aber eng verwandte Arten mit identischen DNA-Sequenzen werden nicht unterschieden und dem besten Treffer zugeordnet.

Wählen Sie mindestens ein 16S-Target (für die Erstellung von Bakterienprofilen), ein ITS-Target (für die Erstellung von Pilzprofilen) oder benutzerdefinierte, am besten von Fachkollegen akzeptierte Targets wie COI, rbcL, 12S oder 18S. Die Standard-Primersätze von Microsynths finden Sie in unserem User Guide Amplicon Metagenomics. Jedes Primer-Set amplifiziert bestimmte Spezies nicht. Wir empfehlen Ihnen, die verfügbare Literatur über die Einschränkungen der einzelnen Primer-Sets sorgfältig zu prüfen.

Dies könnte mehrere Gründe haben, z. B. dass das ausgewählte Primer-Set diese bestimmte Art nicht amplifiziert, dass die Art nicht vollständig aufgelöst werden kann, da die amplifizierte und detektierte Sequenz zu konserviert ist (für die gesamte Gattung oder sogar eine höhere taxonomische Ebene), dass die Sequenz zwar detektiert wurde, aber nicht in der Datenbank vorhanden ist.