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RP-HPLC, IEX-HPLC und HPLC-Aufreinigung & Dialyse

 
Oligonukleotide werden mittels Festphasensynthese assembliert. Dabei werden die Nukleotide entsprechend der gewünschten Sequenz angehängt, was zu einem Kettenwachstum führt. Es ist allgemein bekannt, dass bei chemischen Reaktionen nie eine 100%ige Umsetzung erreicht wird. Bei der Oligonukleotidsynthese nach dem Stand der Technik werden Kopplungsausbeuten von bis zu 99,5% erreicht. Bei den nicht umgesetzten 0,5 % der Stränge kommt der Kettenaufbau zum Stillstand und es bilden sich verkürzte Sequenzen als Nebenprodukte.
Je nach Anwendungszweck ist es vorteilhaft, diese kürzeren Sequenzen aus dem Volllängenprodukt zu entfernen. Daher bietet Microsynth verschiedene Arten von Aufreinigungsmethoden an.

Übersicht

RP-HPLC Aufreinigung

Oligos mit einer Länge von <50 nt können über RP-HPLC (reverse-phase high-performance liquid chromatography) gut aufgereinigt werden. Durch diesen Aufreinigungsansatz werden vorzugsweise restliche, n-x-verkürzte Oligos (denen die hydrophobe DMT-Schutzgruppe am 5'-Ende fehlt) entfernt. Dies führt zu einer ≥85%igen Reinheit des gewünschten Oligonukleotids. RP-HPLC ist nützlich für einen höheren Reinheitsgrad, der für anspruchsvollere Anwendungen wie Klonen, DNA-Fingerprinting, Echtzeit-PCR, FISH usw. erforderlich ist.

Mögliche Anwendungen:

  • Molekulare Klonierung
  • DNA-Fingerprinting
  • Real-Time PCR und digital PCR*
  • FISH

* Microsynth Primer und qPCR-Sonden sind mit allen kommerziell erhältlichen Supermixes kompatibel

IEX-HPLC Aufreinigung

IEX-HPLC (ion-exchange high-performance liquid chromatography) ist eine bevorzugte Reinigungsmethode für längere Oligonukleotide (40-80 nt). Durch diesen Reinigungsansatz werden die restlichen n-x-abgeschnittenen Oligos effizient entfernt. Während die RP-Reinigung sehr gute Ergebnisse für Oligos < 50 nt liefert, ist die IEX-Reinigung für längere Oligonukleotide überlegen. (40-80 nt). Für Oligos mit dieser Länge führt IEX zu einer Reinheit von ≥85% des Ziel-Oligonukleotids. IEX ist nützlich für einen höheren Reinheitsgrad von langen Oligonukleotiden, die für anspruchsvollere Anwendungen wie direktes Klonen oder NGS-Anwendungen benötigt werden.

Mögliche Anwendungen:

  • Molekulares Klonen (direktes Klonen)
  • NGS-Anwendungen

HPLC Aufreinigung & Dialyse

Die Dialyse als Zusatz zur HPLC wird empfohlen, wenn die Oligos in einem physiologischen Zustand vorliegen müssen. Bei der Durchführung von in vivo Experimenten (z. B. in Mäusen) wird dieser Reinheitsgrad dringend empfohlen.

Mögliche Anwendungen:

  • Antisense-Experimente
  • Zellkultur-Studien
  • Physikalische Chemie und Strukturanalyse (NMR, MS etc.)

DNA Ausbeuten

 
RP-HPLC Purified DNA Oligos 
Synthesis scale1 Length Restriction Guaranteed Yield2 Production Time [wd]
[OD260] [nmol]3
Genomics not available
0.04 µmol 13 - 50 1 5 2
0.2 µmol 6 - 50 3 15 2
1.0 µmol 6 - 50 15 75 2
15 µmol 6 - 50 300 1'500 3
 
IEX-HPLC Purified DNA Oligos 
Synthesis scale1 Length Restriction Guaranteed Yield2 Production Time [wd]
[OD260] [nmol]5
Genomics not available
0.04 µmol not available
0.2 µmol 40 - 80 2 3.3 3-5
1.0 µmol 6 10 3-5
15 µmol not available
 
HPLC Purified & Dialysed DNA Oligos 
Synthesis scale1 Length Restriction Guaranteed Yield2 Production Time [wd]
[OD260] [nmol]3
Genomics not available
0.04 µmol not available
0.2 µmol 8 - 50 3 15 3
1.0 µmol 8 - 50 15 75 3
15 µmol 8 - 50 200 1'000 4
 
 
 
1 Die Syntheseskala stellt die Ausgangsmenge an 3'-Basen (Ausgangsmaterial) dar.
2 Unsere garantierten und durchschnittlichen Ausbeuten sind in OD gemessen und gelten nur für unmodifizierte Oligos >20mer.
3 Die in nmol angegebenen Ausbeuten stellen eine Beispielrechnung für ein 20mer dar. Für diese Berechnung wurde die folgende Faustformel angewendet: nmol Oligo = OD x 100/Länge des Oligos. Bitte beachten Sie, dass diese Berechnung auf Sequenzen mit nahezu homogener Verteilung der 4 DNA-Basen basiert; sie kann bei Sequenzen mit hohem GC-Gehalt >70% etc. abweichen.
4 Oligos, die länger als 150 DNA-Basen sind, auf Anfrage (wir möchten das geplante Experiment/die Anwendung vorher mit Ihnen besprechen, um das bestmögliche Ergebnis zu gewährleisten)
5 Die in nmol angegebenen Ausbeuten stellen eine Beispielrechnung für ein 60mer dar. Faustformel: nmol Oligo = OD x 100/Länge des Oligos.

RNA Ausbeuten

 
HPLC Purified RNA Oligos 
Synthesis scale1 Length Restriction Guaranteed Yield2 Production Time [wd]
[OD260] [nmol]3
Genomics not available
0.04 µmol 10 - 30 1 5 2
0.2 µmol 10 - 50 3 15 2
1.0 µmol 13 65 2
15 µmol 10 - 40 300 1'500 4
 
HPLC Purified & Dialysed RNA Oligos 
Synthesis scale1 Length Restriction Guaranteed Yield2 Production Time [wd]
[OD260] [nmol]3
Genomics not available
0.04 µmol not available
0.2 µmol 10 - 50 2 10 4
1.0 µmol 9 45 4
15 µmol 10 - 40 200 1'000 4
 

 

1 Der Synthesemaßstab entspricht der Ausgangsmenge an 3'-Basen (Ausgangsmaterial).
2 Unsere garantierten und durchschnittlichen Ausbeuten sind in OD gemessen und gelten nur für unmodifizierte Oligos >20 und <40 Nukleotide.
3 Die in nmol angegebenen Ausbeuten stellen eine Beispielrechnung für ein 20mer dar. Für diese Berechnung wurde die folgende Faustformel angewendet: nmol Oligo = OD x 100/Länge des Oligos. Bitte beachten Sie, dass diese Berechnung auf Sequenzen mit nahezu homogener Verteilung der 4 RNA-Basen basiert.