Hints and Tips

Handhabung von DNA-Oligos

Bitte beachten Sie beim Umgang mit DNA-Oligonukleotiden Folgendes:

• Stellen Sie sicher, dass Sie nur nukleasefreie Lösungen verwenden (siehe unseren Vorschlag unten für mögliche Lösungsmittel)
• Gehen Sie vorsichtig vor, um eine bakterielle Kontamination zu vermeiden
• Oligos sind im Allgemeinen bei höheren Konzentrationen stabiler
• Einige Fluoreszenzfarbstoffe (insbesondere Cy-Farbstoffe) sind besonders lichtempfindlich, die Lichtexposition sollte minimiert werden. Außerdem können einige Farbstoffe empfindlich gegenüber Oxidation sein. Achten Sie daher bitte darauf, dass Sie das Röhrchen nur bei Bedarf öffnen.

Wie löst man sein Oligo auf?

Im Allgemeinen lassen sich Oligonukleotide am besten in sterilem Wasser oder 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) lösen. Es gibt jedoch ein paar Ausnahmen, die besondere Aufmerksamkeit erfordern:

• Oligos, die einen Fluoreszenzfarbstoff tragen, sollten nicht in destilliertem Wasser aufgelöst werden. Destilliertes Wasser hat in der Regel einen pH-Wert von ~6,0, der den Abbau des Fluoreszenzfarbstoffs begünstigt. Verwenden Sie in solchen Fällen nur 10 mM Tris-HCl-Puffer bei pH 7,5.
• Oligos mit Fluoreszenzfarbstoffen der Cyanin-Familie wie Cy3 etc. sollten nicht in 10 mM Tris-HCl-Puffer bei pH 7,5 gelöst werden, da sie bei pH >7,5 langsam abgebaut werden. Verwenden Sie in solchen Fällen nur destilliertes Wasser.

Wie wird Ihr Oligo neu suspendiert?

• Führen Sie einen kurzen Spin bei maximaler Geschwindigkeit in einer Zentrifuge durch, um das Pellet am Boden des Röhrchens zu sammeln
• Fügen Sie eine entsprechende Menge steriles Wasser oder Puffer hinzu
• Erwärmen Sie das Röhrchen für 5 Minuten bei 65 °C
• Vortexen oder mischen durch kräftiges Auf- und Abpipettieren

Wie werden komplementäre Oligos annealt?

Möglichkeit 1:
Materialien:
1x Annealing-Puffer (z. B. Tris-HCl 10 mM, pH 7,5-8, 20 mM NaCl oder ein anderer häufig verwendeter Puffer)

• Lösen Sie Ihre Oligos mit 200 µM im Annealing-Puffer auf. Verwenden Sie daher die Hälfte des im technischen Datenblatt angegebenen Puffervolumens.
• Mischen Sie die beiden Oligos in einem Verhältnis von 1:1
• Erhitzen Sie die Lösung auf 92°C und halten Sie sie für 2 Minuten
• Kühlen Sie auf RT ab, indem Sie das Röhrchen von der Heizquelle nehmen.

Ihr Doppelstrang wird als 100 µM (100 nmol/ml) in Tris-HCl, pH 7,5-8, 20 mM NaCl (oder alternativem Puffer) annealed.

Möglichkeit 2:
Materialien:
5x-Annealing-Puffer (d.h. Tris-HCl 50 mM, pH 7,5-8, 100 mM NaCl oder alternativer, häufig verwendeter 5x-Puffer)

• Lösen Sie Ihr Oligo bei 100 µM in reinem Wasser auf (Angaben zum Volumen im technischen Datenblatt). Alternativ können Sie die Oligos auch bereits gelöst als 100 µM (100 nmol/ml) bei Microsynth bestellen.
• Mischen Sie die beiden Oligos im Verhältnis 1:1
• Puffer im Verhältnis von 4 Teilen Oligo-Lösung und 1 Teil 5x Annealing-Puffer 4:1 (v:v) zugeben
• Erhitzen Sie die Lösung auf 92°C und halten Sie sie für 2 Minuten
• Kühlen Sie auf RT ab, indem Sie das Röhrchen von der Heizquelle nehmen.

Ihr Doppelstrang wird als 40 µM (40 nmol/ml) in Tris-HCl, pH 7,5-8, 20 mM NaCl (oder alternativem Puffer) annealed.

Lagerung von DNA-Oligos

Wenn Sie Oligonukleotide lagern wollen, beachten Sie bitte Folgendes:

• Bitte vermeiden Sie wiederholtes Auftauen und Einfrieren, da die dabei auftretenden physikalischen Kräfte Ihre Oligos degradieren können
• Wählen Sie je nach Experiment eine geeignete Lagerbedingung (siehe unsere Vorschläge für mögliche Lagerbedingungen weiter unten)
• Die Anfertigung von Aliquots kann sinnvoll sein, wenn Oligos über einen längeren Zeitraum gelagert und verwendet werden müssen, ohne an Aktivität zu verlieren

Handhabung von RNA-Oligos

Beim Umgang mit RNA-Oligonukleotiden ist Folgendes zu beachten:

• Stellen Sie sicher, dass Sie RNase-frei arbeiten und nur Nuklease-freie Lösungen verwenden (siehe unseren Vorschlag unten für mögliche Lösungsmittel)
• Gehen Sie vorsichtig vor, um bakterielle Kontaminationen zu vermeiden
• Oligos sind im Allgemeinen bei höheren Konzentrationen stabiler
• Einige Fluoreszenzfarbstoffe (insbesondere Cy-Farbstoffe) sind besonders lichtempfindlich und sollten in lichtdichten Gefäßen gelagert werden. Außerdem können einige Farbstoffe empfindlich gegenüber Oxidation sein. Achten Sie daher bitte darauf, dass Sie das Röhrchen nur bei Bedarf öffnen.

Wie lösen Sie Ihre siRNA oder einzelsträngige RNA auf?

Im Allgemeinen lassen sich Oligonukleotide am besten in sterilem RNase-freiem Wasser oder 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) lösen. Es gibt jedoch ein paar Ausnahmen, die besondere Aufmerksamkeit erfordern:

• Oligos, die einen Fluoreszenzfarbstoff tragen, sollten nicht in destilliertem Wasser aufgelöst werden. Destilliertes Wasser hat in der Regel einen pH-Wert von ~6,0, der den Abbau des Fluoreszenzfarbstoffs begünstigt. Verwenden Sie in solchen Fällen nur 10 mM Tris-HCl-Puffer bei pH 7,5.
• Oligos mit Fluoreszenzfarbstoffen der Cyanin-Familie wie Cy3 etc. sollten nicht in 10 mM Tris-HCl-Puffer bei pH 7,5 gelöst werden, da sie bei pH >7,5 langsam abgebaut werden. Verwenden Sie in solchen Fällen nur destilliertes Wasser.

Wie wird Ihre siRNA re-suspendiert oder annealed?

siRNA wird in der Regel als angelagerte, gereinigte und gebrauchsfertige Duplexe (40uM) in Annealing-Puffer (10 mM TRIS-HCl pH 7.5 und 20 mM NaCl) geliefert. Auf Wunsch liefern wir sie aber auch in getrockneter Form als Einzelstränge in zwei separaten Röhrchen. Wenn Sie nicht wissen, wie Sie annealen sollen, beachten Sie bitte das folgende Protokoll:

• Bereiten Sie 100 µM-Lösungen von jedem RNA-Strang vor. Kombinieren Sie 30 µl jeder RNA-Oligolösung und fügen Sie 15 µl 5x-Annealing-Puffer hinzu, um ein Endvolumen von 75 µl zu erreichen. Die Endkonzentration des Duplex sollte 40 µM betragen.
• Inkubieren Sie die Lösung für 1-2 Minuten bei 90-95 °C. Halten Sie diese Lösung dann auf dem Arbeitstisch, bis sie Raumtemperatur erreicht hat (das Abkühlen sollte relativ langsam erfolgen und ca. 45-60 Minuten dauern). Zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz, um alle Flüssigkeit am Boden des Röhrchens aufzufangen.
• Nach dem Annealing ist die Duplex-siRNA viel resistenter gegen Nukleasen als einzelsträngige RNA und wird am besten bei -20 °C gelagert. Der 5x-Annealing-Puffer kann bis zu 5 Mal eingefroren und aufgetaut werden.

Wie wird einzelsträngige RNA re-suspendiert?

• Führen Sie einen kurzen Spin bei maximaler Geschwindigkeit in einer Zentrifuge durch, um das Pellet am Boden des Röhrchens zu sammeln
• Fügen Sie eine entsprechende Menge steriles RNase-freies Wasser oder Puffer hinzu
• Erhitzen Sie das Röhrchen für 2-3 Minuten bei 90 °C
• Vortexen oder mischen durch kräftiges Auf- und Abpipettieren

Vorsichtsmaßnahmen gegen RNase-Kontamination

RNA ist aufgrund ihrer freien 2'-Hydroxy-Gruppe anfällig für Degradation. Hauptursachen für den Abbau sind die Aktivität von RNasen sowie die verlängerte Inkubation in alkalischen Lösungen. Bitte beachten Sie die folgenden Vorsichtsmaßnahmen, um Ihre RNA intakt zu halten:

• Arbeiten Sie immer mit frischem Einweg-Plastikverbrauchsmaterial (z. B. markieren Sie einen Beutel mit Schläuchen und legen Sie ihn beiseite. Greifen Sie niemals in den Beutel, sondern lassen Sie die Röhrchen aus dem Beutel fallen. Dies gilt auch für Pipettierspitzen). Wenn Sie Glasgeräte verwenden müssen, beachten Sie, dass RNasen das Autoklavieren überleben können - in diesem Fall backen Sie Ihre Glasgeräte mindestens 4 Stunden bei 250 °C.
• Tragen Sie immer Handschuhe (RNasen sind allgegenwärtig). Wechseln Sie die Handschuhe häufig (Seien Sie sich bewusst, dass jede Oberfläche, die Sie mit Ihren Handschuhen berühren, bereits von einer Person berührt worden sein kann, die keine Handschuhe trägt).
• Verwenden Sie RNase-freies Wasser/Puffer. Das meiste handelsübliche Wasser ist in der Tat RNase-frei. Alternativ dazu können Sie DEPC-Wasser herstellen. DEPC (Diethylpyrocarbonat) reagiert mit den primären Amin-Gruppen und inaktiviert daher RNasen, kann aber nicht für z.B. Tris-Puffer verwendet werden.

Lagerung von RNA-Oligos

Wenn Sie Oligonukleotide lagern wollen, beachten Sie bitte Folgendes:

• Bitte vermeiden Sie wiederholtes Auftauen und Einfrieren, da die dabei auftretenden physikalischen Kräfte Ihre Oligos degradieren können
• Wählen Sie je nach Experiment eine geeignete Lagerbedingung (siehe unsere Vorschläge für mögliche Lagerbedingungen weiter unten)
• Die Anfertigung von Aliquots kann sinnvoll sein, wenn Oligos über einen längeren Zeitraum gelagert und verwendet werden müssen, ohne an Aktivität zu verlieren

Design Guidelines für TaqMan Sonden
Design Guidelines für Primer
Generelle LNA Oligonukleotid Design Guidelines
Design Guidelines für siRNA's

Design Guidelines für Taqman Sonden

• Optimale Länge: 20 Basen
• Längenbereich: 18-30 Basen (Länge über 30 Basen ist möglich; in diesem Fall wird empfohlen, doppelt gequenchte Sonden zu verwenden und einen zusätzlichen internen Quencher in einem Abstand von 8-10 Basen zum Fluorophor zu positionieren.
• Schmelztemperatur (Tm): 68-70°C. Bitte achten Sie darauf, dass die Tm Ihrer Sonde 8-10°C höher ist als die Tm Ihrer Primer (8°C für Genotypisierung, 10°C für Expressionsprofilierung).
• GC-Gehalt: 30-80%
  Vermeiden Sie Läufe mit einem identischen Nukleotid, insbesondere mit 4 oder mehr Gs (sonst kann die Wechselwirkung zwischen den Nukleotiden dazu führen, dass das Oligo eine Sekundärstruktur bildet)
• Wählen Sie den Strang, der der Sonde mehr Cs als Gs gibt (aufgrund der starken Wechselwirkung, die G mit sich selbst aufweist)
  Setzen Sie Gs nicht an das 5'-Ende (löscht das Fluorophor)
• Bei der Verwendung innerhalb von Multiplex-Assays (Allel-Diskriminierung) ist Folgendes zu beachten:
  • Positionieren Sie den Polymorphismus in der Mitte der Sonde
  • Passen Sie die Sondenlänge so an, dass beide Sonden die gleiche Tm haben
  • Wenn sehr kurze Sonden benötigt werden (weniger als 18 Basen), fragen Sie bitte an

Design Guidelines für Primer

• Längenbereich: 18-30 Basen
• Schmelztemperatur (Tm): 58-60°C
• GC-Gehalt: 30-80%
• Vermeiden Sie Läufe von identischen Nukleotiden, insbesondere von 3 oder mehr Gs oder Cs am 3'-Ende
• Die Gesamtzahl der Gs und Cs in den letzten fünf Nukleotiden am 3'-Ende des Primers sollte zwei nicht überschreiten
• Primer sollten die Exon-Exon-Verbindung scannen. Kontaminierende genomische DNA wird von diesen Primern nicht amplifiziert

Generelle LNA Oligonukleotid Design Guidelines

Im Gegensatz zu Standard-DNA- oder RNA-Oligonukleotiden sind Oligonukleotide mit LNA-Nukleotiden aufgrund ihrer deutlich höheren Schmelztemperatur und der damit verbundenen höheren Empfindlichkeit tendenziell kürzer. Beim Design von LNA-haltigen Oligonukleotiden sind die folgenden allgemeinen Regeln zu berücksichtigen:

• LNAs sollten an den Positionen eingeführt werden, an denen Spezifität und Unterscheidung benötigt werden (z. B. am 3'-Ende bei allelspezifischer PCR und an der SNP-Position bei allelspezifischen Hybridisierungssonden).
• Vermeiden Sie Abschnitte mit mehr als 4 LNA-Nukleotiden. LNA hybridisiert sehr eng, wenn mehrere aufeinanderfolgende Reste durch LNA-Nukleotide ersetzt werden.
• Vermeiden Sie LNA-Selbstkomplementarität und Komplementarität zu anderen LNA-haltigen Oligonukleotiden im Assay. LNA bindet sehr eng an andere LNA-Reste.
• Eine typische Primerlänge von 18mer sollte nicht mehr als 8 LNA-Nukleotide enthalten.
• Jedes LNA-Nukleotid erhöht die Tm um ca. 2-4oC.
• Verwenden Sie keine LNA-Blöcke in der Nähe des 3'-Endes.
• Halten Sie den GC-Gehalt zwischen 30-60 %.
• Vermeiden Sie Abschnitte mit mehr als 3 G-DNA oder LNA-Nukleotiden.
• Tm der Primerpaare sollte nahezu gleich sein.

Für sehr spezifische oder neuartige Assay-Einstellungen müssen die Designregeln möglicherweise empirisch ermittelt werden, aber die Befolgung der oben genannten Empfehlungen bietet einen guten Anfang.

Design Guidelines für siRNA's

Die Suche nach der optimalen Designstrategie von siRNA ist ein aktives Forschungsgebiet. In jüngster Zeit haben mehrere Studien die Bedeutung verschiedener Faktoren für eine effektive siRNA unterstrichen. Die Einbeziehung dieser (empirisch abgeleiteten) Kriterien in das Design einer siRNA erhöht die Chance, eine spezifische und hocheffektive siRNA in Bezug auf den Knockdown zu schaffen.

Wichtige Kriterien sind unter anderem die Reynolds-Kriterien [1, 2]:

• Der GC-Gehalt der siRNA sollte 30 % bis 52 % betragen.
• Versuchen Sie, mindestens 3 A/Us an Position 5-19 des Sense-Strangs zu platzieren.
• Achten Sie darauf, dass es keine internen Wiederholungen gibt (Tm der Sekundärstruktur < 20°C).
• Versuchen Sie, ein A an Position 19 des Sense-Strangs zu platzieren.
• Versuchen Sie, eine A-Base an Position 3 des Sense-Strangs zu platzieren.
• Versuchen Sie, eine U-Base an Position 10 des Sense-Strangs zu platzieren.
• Versuchen Sie, eine andere Base als G oder C an Position 19 des Sense-Strangs zu platzieren.
• Versuchen Sie, eine andere Base als G an Position 13 des Sense-Strangs zu platzieren.

Beachten Sie, dass nicht alle diese Kriterien erfüllt sein müssen, aber generell gilt: je mehr, desto besser.

Unser Online-siRNA-Design-Tool sortiert die Ausgabe mit einer Punktzahl, die diese Kriterien widerspiegelt und Ihnen hilft, Ihre siRNAs schnell, zuverlässig und bequem zu designen. Es handelt sich um ein maßgeschneidertes Tool, das veröffentlichte Designkriterien mit Microsynths eigener wertvoller Erfahrung kombiniert. Um unser Design-Tool zu nutzen, loggen Sie sich bitte zunächst in unseren Webshop ein und wählen Sie siRNA > siRNA Design Tool.

1. Boese et al. (2005). Mechanistic Insights Aid Computational Short Interfering RNA Design. Methods in Enzymology. Vol 392. Pages: 73-96
2. Reynolds et al. (2004). Rational siRNA design for RNA interference, Nature Biotechnology. Vol 22. Pages: 326-330

Traditionell ist FAM-TAMRA eines der am häufigsten verwendeten Paare für TaqMan-Sonden, bei dem FAM als Fluorophor und TAMRA als Quencher fungiert. Es können auch andere Quencher verwendet werden, insbesondere Dark Quencher oder Black Hole Quenchers (BHQs), die die Energie eines angeregten Reportermoleküls einfangen, ohne anschließend Licht zu emittieren, d. h. sie fluoreszieren nicht.

Sonden, die unter Verwendung von Dark Quenchern hergestellt werden, sind in quantitativen Detektionssystemen tendenziell empfindlicher, vor allem aufgrund einer geringeren Hintergrundfluoreszenz und eines besseren Signal-Rausch-Verhältnisses als Sonden, die fluoreszierende Quencher enthalten. Darüber hinaus ermöglichen Dark-Quencher die Verwendung einer breiteren Palette von Reporter-Farbstoffen, was die Möglichkeiten für Multiplex- oder Genotypisierungs-Assays erweitert.

Einige Fluorophore können durch mehr als einen Quencher gequencht werden. In jedem Fall muss das Absorptionsspektrum des Quenchers eine gute Überlappung mit dem Emissionsspektrum des Fluorophors aufweisen, um ein optimales Quenching zu erreichen. Quencher haben eine Quenching-Kapazität über ihr gesamtes Absorptionsspektrum, aber die Leistung ist am besten in der Nähe des Absorptionsmaximums.

Für die Multiplex-PCR empfehlen wir die folgenden 5'-Fluorophor-3'-Schwarzloch-Quencher-Kombinationen (sind für die meisten qPCR-Thermocycler mit TaqMan-Sonden geeignet):

• Kanal 1: FAM-MGBQ530
• Kanal 2: HEX/JOE/Yakima Yellow*- MGBQ530 (*equivalent to VIC)
• Kanal 3: ROX**-BHQ-2 (**equivalent to Texas Red)/ATTO550***-BHQ-2 (***equivalent to NED)
• Kanal 4: Cy5-BHQ-2
• Kanal 5: Dy681-BHQ2

Empfohlene Endkonzentrationen für Standardexperimente:

• Primer: 0.9 pmol/µl (0.9 µM)
• Sonde: 0.2 pmol/µl (0.2 µM)

Empfohlene Real-Time-PCR-Bedingungen (Tm Primer: 59 °C, Tm Probe: 69 °C):

• 30 sec 95 °C
• 30 sec 57 °C
• 30 sec 72 °C, 35 Zyklen