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CRISPR/Cas9 Sequenzierung

CRISPR/Cas9 Sequencing
 
 
Verwenden Sie die CRISPR/Cas9 Sequenzierung, um:
  • Ihre Guides Library durch Deep Sequencing zu verifizieren
  • CRISPR/Cas9-Ziele und Mutationseffizienz durch Deep Sequencing von Amplikons zu validieren
  • die Kandidaten mit dem größten Einfluss aus Screenings sowie die Häufigkeit und die Auswirkungen der Edits zu entdecken

 

Übersicht

Überlegungen vor dem Start eines CRISPR/Cas9-Sequenzierungsprojekts:

  • Minimal erforderliche Sequenzierlänge?
  • Sequenziertiefe?
  • Analyse - Häufigkeit versus Mutationsimplikation?
  • Funktioneller Aufbau (Replikate und Bedingungen)?

Lassen Sie sich von uns beraten - vom Design bis zur Analyse

Beispielprojekte mit CRISPR/Cas9-Sequenzierung:

  • Verifizierung von CRISPR/Cas9-Plasmid-Bibliotheken
  • Analyse von Ziel-Loci
  • Analyse von vorhergesagten Off-Target-Loci

Anwendungen im Zusammenhang mit CRISPR/Cas9:

  • Amplicon deep sequencing
  • RNA sequencing
  • Eukaryotic resequencing

Workflow

 
Ein typischer Workflow für ein CRISPR/Cas9-Sequenzierungsprojekt ist in der folgenden Grafik dargestellt. Bitte beachten Sie, dass unsere hochmodularen Prozesse Ihnen verschiedene Einstiegs- und Ausstiegsmöglichkeiten bieten. Ob Sie Ihr gesamtes NGS-Projekt an Microsynth auslagern oder nur Teile davon, bleibt Ihnen überlassen.
 

Weitere Inforamtionen sowie eine detaillierte technische Beschreibung finden Sie in unserer Application Note Illumina CRiSPR/Cas9 Sequenzierung (siehe Download auf der rechten Seite).

Resultate


Unser Gene-Editing Analysemodul befasst sich mit der Analyse von Experimenten, bei denen ein bestimmtes Gen durch molekularbiologische Techniken wie CRISPR/Cas9 editiert wird. Das Modul ist so konzipiert, dass es sowohl bei der Pre- als auch bei der Post-Editing-Analyse hilft. Sie können sowohl Ihre Plasmidbibliothek, welche die sgRNAs enthält, als auch die Zielgene analysieren, nachdem die Gen-Editierung stattgefunden hat. Es werden Antworten auf die folgenden wichtigen Fragen gegeben:

  1. Welche sgRNAs sind in der Plasmidbibliothek vorhanden und wie hoch ist deren Häufigkeit? (siehe Abbildung 1)
  2. War das Gene-Editing-Ereignis erfolgreich und wenn ja, wie war der Effekt auf das Zielgen im Vergleich zu seiner Referenzsequenz? (siehe Abbildung 2+3 und Tabelle 1)
  3. Was ist die Folge einer bestimmten Behandlung im Vergleich zu einer Kontrollgruppe? (komplementäre vergleichende Dereplikationsanalyse) (siehe Abbildung 4)

Die Analyse der Plasmidbibliothek erfordert keine Referenzen und als Ergebnisse werden die sequenzierten sgRNAs mit ihren Häufigkeiten geliefert.

Für die Post-Editing-Analyse werden die editierten Gene amplifiziert, sequenziert und mit der Referenzsequenz verglichen. So werden Insertionen und Deletionen (InDels) identifiziert und zusammen mit ihren Häufigkeiten beschrieben.

 

Abbildung 1: Ausschnitt aus einer FASTA-Datei mit eindeutigen Sequenzen, die mit dem erwarteten Sequenzierfehler und der Sequenzhäufigkeit annotiert sind.

Abbildung 2: Histogramm der gelöschten Positionen im Vergleich zur unveränderten Referenzsequenz.

Abbildung 3: Histogramm der Deletionsgrößen.

 
Tabelle 1: Ausschnitt aus einer Ergebnistabelle, in der die InDel-Struktur der dereplizierten Sequenzen zusammen mit ihren Häufigkeiten innerhalb des Datensatzes aufgelistet ist.
 
Abbildung 4: PCA basierend auf der Häufigkeit der dereplizierten Sequenzen pro Probe und gruppiert nach zwei Bedingungen.
 

Bearbeitungszeiten

 

  • Lieferung der Daten innerhalb von 25 Arbeitstagen nach Probeneingang (inklusive Library Erstellung und Sequenzierung)
  • Weitere 10 Arbeitstage für die Datenanalyse (Bioinformatik)
  • Express-Service auf Anfrage möglich